Что такое рестриктаза?
Рестриктаза — это пара молекулярных ножниц, которые бактерии выработали как иммунную систему: она патрулирует клетку и разрезает чужеродную ДНК (обычно вирусную) везде, где появляется одна конкретная короткая последовательность, в то время как собственная ДНК бактерии защищена химическими метками. Рестриктазы типа II, используемые в молекулярной биологии, узнают последовательность из 4–8 оснований и режут в определённой позиции внутри неё или рядом — программируемые ножницы: выберите сайт, и вы точно знаете, где пройдёт разрез.
Одно число, которое нужно запомнить: шестиосновный сайт узнавания, такой как GAATTC у EcoRI, случайно встречается примерно раз на 46 = 4096 п.н. случайной ДНК. Поэтому расщепление генома даёт тысячи фрагментов, а расщепление небольшой плазмиды обычно даёт горстку — чем короче ДНК, тем меньше сайтов она содержит.
Сайты узнавания, липкие и тупые концы
Большинство сайтов типа II палиндромны: последовательность читается одинаково на обеих цепях (EcoRI читает GAATTC, идёте ли вы по верхней или по нижней цепи). EcoRI режет между G и A, оставляя одноцепочечные выступы AATT — «липкие» концы, которые отжигаются с любым другим выступом AATT. Ферменты вроде SmaI (CCC^GGG) и EcoRV режут строго поперёк обеих цепей и оставляют тупые концы, которые можно соединить с любым другим тупым концом, но лигируются они гораздо менее эффективно. BamHI и BglII узнают разные последовательности, но оба оставляют один и тот же выступ GATC, поэтому их фрагменты можно лигировать друг с другом, хотя гибридный сайт после этого не совпадает ни с одним из ферментов. Именно этот приём лежит в основе модульного клонирования.
Одиночное расщепление, двойное расщепление, карта фрагментов
Одиночное расщепление отвечает на вопрос «где этот фермент режет мою последовательность?»; фрагменты, которые он перечисляет, — это полосы, которые вы увидите после гель-электрофореза. Двойное расщепление режет сразу двумя ферментами — стандартный способ картирования плазмиды, потому что совокупность фрагментов фиксирует, где находятся сайты каждого фермента относительно друг друга. Учтите, что этот анализатор считает вход линейной последовательностью: линейная молекула с N сайтами разрезания даёт N+1 фрагментов, тогда как кольцевая плазмида с N сайтами даёт ровно N фрагментов.
Вырожденные сайты узнавания
Некоторые ферменты читают позиции, допускающие более одного основания; их записывают буквами IUPAC: BstEII узнаёт GGTNACC (N = любое основание), StyI узнаёт CCWWGG (W = A или T). Панель поиска сайтов принимает тот же алфавит, поэтому вы сами можете просканировать любую последовательность на такие вырожденные шаблоны — например, GANTC, сайт HinfI.
Распространённые заблуждения
- «Одинаковый сайт узнавания означает один и тот же фермент.» SmaI и XmaI оба читают
CCCGGG, но режут его по-разному (тупой и липкий конец); одна только узнаваемая последовательность никогда не сообщает вам позицию разреза. - «Значения буфера и инактивации нагреванием в базе данных — это законы.» Это типичные значения производителей; буферы различаются у разных поставщиков, а некоторым ферментам нужны особые условия — всегда сверяйтесь с актуальным паспортом продукта перед постановкой реакции.
- «Нет сайтов разрезания значит, фермент сломан.» Гораздо чаще сайт есть, но заблокирован — метилирование dam/dcm у бактерий накрывает мотивы GATC и CCWGG и останавливает несколько ферментов (BclI — классическая жертва).
Связанные инструменты: Анализ последовательностей (GC-состав и MW ДНК, которую вы режете), Конструктор праймеров (амплификация нужного фрагмента) и Биокалькуляторы (сколько расщепления вносить в реакцию).
